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外泌体长链非编码RNA(lncRNA)已被发现与癌症的发生有关。然而,外泌体lncRNAs在肝细胞癌(HCC)中的表达特征及生物学作用尚不清楚。近期,Cancer Science(IF6.710)期刊在线发表了题为RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma的研究论文,系统地表征了外泌体lncRNAs在HCC-exos中的表达特征,同时鉴定出了在细胞增殖、迁移和凋亡调控中发挥重要作用的特异性DE-lncRNAs。发现lnc85可作为肝癌发生的致癌lncRNA,并且其在HCC血清中升高,在HCC诊断中显示出了巨大的潜力。该研究为外泌体lncRNA失调与HCC之间的关系提供了新的见解,并且提示lnc85可能是HCC的潜在生物标志物。

 

lnc85在肝癌中的工作模型

 

 

 

主要研究结果

 

▪ 外泌体鉴定

首先,使用Ribo Exosome Isolation Reagent从HCC和HC(健康对照)血浆中分离出外泌体。然后,通过NanoSight、TEM和western blot对分离的外泌体进行分析。结果显示,80%以上的粒径在30-150 nm范围内,在59 nm处出现峰值。TEM扫描结果表明,颗粒由双层膜组成(~100nm)。此外,在血浆外泌体中检测到外泌体生物标志物Alix和CD63的表达。

 

 

▪ 外泌体lncRNAs和mRNAs在HC-exos和HCC-exos之间差异表达

随后,研究人员进行了外泌体RNA测序,分析了HCC和HC中外泌体lncRNAs和mRNAs的表达谱。结果显示共鉴定了8572个DE-lncRNAs,其中8447个在HCC-exos中上调,125个下调。同样,在HCC-exos中有9440个DE-mRNAs,其中8963个上调,477个下调。火山图和层次聚类分析表明这些差异外泌体lncRNAs具有区分HCC和HC的能力。与外泌体lncRNAs类似,HCC-exos中外泌体mRNAs的表达谱也与HC-exos不同。

 

 

▪ 与HCC-exos中的mRNAs相比,长链非编码RNAs具有更高的表达水平和组织特异性以及更低的变异性和剪接效率

接着,研究人员对差异表达的lncRNAs和mRNAs进行了分析。结果发现,在HCC-exos中,lncRNAs的中位表达水平几乎是mRNAs的两倍,而在HC-exos中无显著差异。在HC-exos中,外泌体lncRNAs的特异性转录率显著高于外泌体mRNAs。这种现象在HCC-exos中更强。此外,无论是在HCC-exos还是在HC-exos中,lncRNAs的剪接效率都低于mRNAs。而且HCC-exos中lncRNAs的表达变异性显著低于mRNAs。

 

 

▪ HCC细胞和细胞外泌体中DE-lncRNAs的qRT-PCR验证

为了确定血浆外泌体RNA测序结果是否可以在HCC细胞中得到验证,研究人员采用qRT-PCR检测6个DE-lncRNAs在HCC细胞及其细胞外泌体中的表达水平。结果显示,除lnc380外,其他5个DE-lncRNAs(lnc544、lnc239、lnc959、lnc171和lnc85)在2种HCC细胞系中的表达水平高于7702细胞。类似的,除了lnc380外,其他5个DE-lncRNAs在HCC细胞外泌体中的表达水平高于7702-exos。

 

▪ 敲低HCC相关的DE-lncRNAs改变了HCC细胞的表型
为了探索5个候选DE-lncRNAs是否在细胞增殖、侵袭和凋亡中发挥作用,研究人员使用特定siRNA敲低HCC细胞中的这些DE-lncRNAs。结果发现抑制lnc85导致细胞增殖受损;沉默其他4个DE-lncRNAs几乎没有影响。在Transwell分析中,沉默lnc85导致HCC细胞迁移减少,敲低lnc239导致Huh7细胞迁移减少,抑制lnc959减少HepG2细胞的迁移,而沉默lnc544和lnc171对细胞迁移没有显著影响。在细胞凋亡分析中,下调lnc85可以提高Huh7细胞的细胞凋亡,抑制lnc171可以显著增加HepG2细胞凋亡,敲低lnc544可以略微增加Huh7细胞的凋亡。

 

 

 

▪ lnc85可充当miR-324-5p海绵

众所周知,lncRNAs可作为竞争性内源性RNA(ceRNA)来调节miRNA的表达和生物学功能,并参与细胞生物学过程。为了研究DE-lncRNAs的ceRNA特征,研究人员重点关注了一种在HCC-exos中高度上调的新型lncRNA lnc85,以探索其如何影响HCC细胞的增殖和侵袭。

首先,研究人员通过RegRNA预测了lnc85的潜在靶点,发现lnc85的3′ -UTR端含有miR-324-5p的预测结合位点。随后的双荧光素酶报告基因实验显示,miR-324-5p mimic显著抑制了HepG2和Huh7细胞中lnc85 WT 3’UTR的荧光素酶活性,而miR-324-5p mimic对突变体3’UTR的荧光素酶活性没有显著影响。此外,qRT-PCR分析证实,HCC细胞中miR-324-5p的表达与lnc85呈负相关。转染si85可抑制lnc85的表达水平,但同时上调HCC细胞中miR-324-5p的表达水平。表明miR-324-5p可能作为lnc85的抑制靶点。

 

 

▪ lnc85通过调节miR-324-5p相关靶基因的表达促进HCC细胞增殖、转移和凋亡

之前的研究已经证实lnc85靶向miR-324-5p,因此研究人员探索了沉默lnc85后对miR-324-5p下游靶基因表达水平的影响。结果表明,沉默lnc85显著抑制了HCC细胞中miR-324-5p下游几种增殖蛋白(细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B1和c-myc)的mRNA表达水平。此外,抑制lnc85导致参与促侵袭/转移的miR-324-5p靶标(MMP2和MMP9)的下调。表明沉默lnc85会影响mir-324-5p下游增殖、抗凋亡和转移相关基因的mRNA表达水平,尤其是增殖和侵袭基因。

 

 

mir-324-5p通过调节MMP2和MMP9的活性抑制HCC细胞侵袭和迁移的机制已有详细报道。研究人员通过western blot研究了lnc85沉默后增殖相关蛋白(细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白B1)的蛋白表达水平。结果显示,与siNC组相比,在Huh7和HepG2细胞的siRNA组中发现细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白B1的水平降低。总之,这些结果表明lnc85可能通过调节miR-324-5p靶基因的表达来改变这些细胞的增殖、迁移和凋亡。

 

 

▪ lnc85是HCC的生物标志物

DE-lncRNAs已被证实可作为人类疾病的生物标志物。RNA测序结果发现lnc85是在AFP+和AFP-HCC-exos中高度表达的DE-lncRNAs之一,并显示出成为HCC生物标志物的潜力。为了探讨lnc85是否可作为HCC的生物标志物,研究人员采用qRT-PCR检测了lnc85在112例HCC、43例LC和52例HCC患者血清中的表达水平。结果发现与HC和LC相比,lnc85在HCC中高表达。更重要的是,lnc85的表达水平不仅在AFP+ HCC中显著升高,而且在AFP- HCC中也高表达。

 

 

接下来,研究人员采用受试者工作特征曲线分析结果来分析lnc85的诊断价值。分析结果如下:

①当HC和LC合并为1组(HC+LC)时,lnc85的AUC对于HCC为0.873,敏感性和特异性分别为80.0%和74.5%。

②为了区分LC和HCC,lnc85的AUC为0.888,lnc85的敏感性和特异性分别为80.0%和74.4%。

③当HC和LC合并为1组(HC+LC)时,lnc85的AUC对于AFP+HCC为0.883,对于AFP-HCC为0.869。lnc85诊断AFP+ HCC的敏感性和特异性分别为80.5%和76.5%;在诊断AFP-HCC的敏感性和特异性分别为80.0%和76.5%。

④为了区分LC和AFP+或AFP-HCC,lnc85的AUC对于AFP+ HCC为0.897,对于AFP- HCC为0.883。lnc85诊断AFP+ HCC的敏感性和特异性分别为80.5%和76.7%;诊断AFP-HCC的敏感性和特异性分别为80.0%和76.7%。这意味着lnc85在AFP+和AFP-HCC中都显示出令人信服的诊断潜力。

 

 

因此,lnc85可用作HCC诊断的独立生物标志物,或与其他生物标志物结合以改善AFP-HCC的诊断。

 

 

原文链接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/cas.14516

 

 

 

本研究中的外泌体提取试剂盒、外泌体RNA测序服务有锐博生物提供!

 

 

 

 

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